产品货号:
ALH533
中文名称:
染料法qPCR预混液
英文名称:
2×SYBR Green qPCR Mix
产品规格:
125T|500T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR Green I等试剂预混成一种适合Real-Time PCR反应检测用2×预混型试剂,具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板和引物和水,便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对目的基因进行准确定量检测,重复性好,可信度高。
本制品采用全新的Hotmaster Taq DNA聚合酶,该酶不同于一般Hot-start酶之处在于,一般的Hot-start酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性,而Hotmaster Taq DNA聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster TaqDNA聚合酶的底物结合位点,温度低于40℃时,形成非活性的酶-抑制剂复合物,当温度升高至引物特异性的退火温度时,结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动,因此最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生,大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。
- 本制品不含参比染料ROX,客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料,用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
- 本制品含SYBR Green I强光下易分解,降低敏感度,使用时避免长时间强光照射本制品。
- 建议在冰上配制PCR反应液,再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性,减少背景。
- 本制品含有4mM MgCl2(反应体系终浓度是2mM Mg2+),可用25mM MgCl2优化Mg2+浓度。
组分 | 125T | 500T |
2×SYBR Green qPCR Mix | 1.25mL | 4×1.25mL |
说明书 | 1份 | 1份 |
保存:-20℃避光保存至少6个月,使用前充分融解混匀。短期使用可放在4℃,避免反复冻融。
- 按下表加入各成分配制反应体系,操作请在冰上进行。
成分 20μL体系 50μL体系 终浓度 2×SYBR Green qPCR Mix 10μL 25μL 1× DNA Template 1μL 2μL as required Forward Primer (10μM) 0.4μL 1μL 0.2μM each Reverse Primer (10μM) 0.4μL 1μL 0.2μM each ddH2O 至20μL 至50μL - - PCR反应程序
- 两步法
温度 时间 循环数 95℃ 2min 1 95℃ 15sec 40 60℃ 30~34sec - 三步法
温度 时间 循环数 95℃ 2min 1 95℃ 15sec 40 60℃ 15~20sec 72℃ 20~30sec
- 本制品兼容性强,适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪,绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说,二步法扩增特异性高,三步法扩增效率高。如果融链曲线较差,可以尝试两步法扩增;若因使用Tm值较低的引物等原因,得不到良好的实验结果时,可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。
- 两步法
- 无信号值出现
- 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45cycles),但高于45个
循环会增加过多的背景信号。 - 检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束
采集信号。 - 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
- 引物或探针的设计,如探针高于引物的温度不够,造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
- 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
- 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
- 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45cycles),但高于45个
- CT值出现过晚
- 扩增效率低,反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;用三步法进行反应;适当降低退火温度;增
加镁离子浓度等。 - PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
- PCR产物太长。一般采用100~150bp的产物长度,一般不超过500bp。
- 扩增效率低,反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;用三步法进行反应;适当降低退火温度;增
- 标准曲线的线性关系不佳
- 加样存在误差,使得标准品不呈梯度。
- 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。
- 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
- 模板中存在抑制物,或模板浓度过高。
- 加样存在误差,使得标准品不呈梯度。
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